體積排阻色譜柱：原理、應用及與其他色譜柱的比較！
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體積排阻色譜柱(Size Exclusion Chromatography Column，簡稱 SEC 柱)是液相色譜中一種基于分子尺寸(體積)差異實現分離的特殊色譜柱，廣泛應用于生物化學、高分子材料、藥物分析等領域。以下從基本定義、分離原理、核心應用場景三方面展開介紹：
一、體積排阻色譜柱的定義
體積排阻色譜柱內部填充有多孔性凝膠填料(如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺或硅膠基質微球)，其分離機制不依賴分子的電荷、極性或疏水性，而是完全基于分子的尺寸( hydrodynamic volume)和形狀。
關鍵特點：
填料孔徑大小決定分離范圍(如小分子可進入小孔，大分子被排阻)。
分離過程溫和，適合不耐高溫、易變性的生物大分子(如蛋白質、核酸、多糖等)。
二、分離原理：分子篩效應(Molecular Sieving)
1、核心機制
流動相攜帶樣品進入色譜柱，分子根據尺寸差異擴散到填料孔隙中：
大分子：無法進入填料微孔，只能沿填料顆粒間的空隙流動，路徑短，保留時間短，先流出。
小分子：可進入填料微孔內部，流動路徑長，保留時間長，后流出。
分離結果：分子按尺寸從大到小依次洗脫，實現分級分離。
填料顆粒結構：〇〇〇(多孔網絡)
大分子 → 直接通過顆粒間隙 → 快速流出
小分子 → 進入孔隙內部 → 緩慢流出
2、影響分離的關鍵參數
填料孔徑：決定可分離的分子量范圍(如孔徑小的柱子適合分離低分子量物質)。
柱長與流速：柱長增加可提高分離度，流速過快可能降低分離效果。
流動相組成：需維持樣品溶解性和穩定性(如緩沖液 pH、離子強度等)。
三、應用場景
體積排阻色譜柱因其溫和性和尺寸選擇性，在以下領域發揮關鍵作用：
1. 生物大分子分析
蛋白質與多肽：
分離蛋白質單體、多聚體(如抗體藥物的聚集體檢測)。
測定蛋白質分子量分布(需結合標準品校正)。
監測蛋白降解或變性(如溫度、pH 對蛋白結構的影響)。
核酸：
分離 DNA/RNA 的不同構型(如超螺旋 DNA 與線性 DNA)。
評估核酸完整性(如降解產物與完整鏈的區分)。
多糖與疫苗：
分析疫苗中多糖的分子量均一性(如肺炎疫苗多糖純度檢測)。
分離病毒樣顆粒(VLPs)或病毒載體的完整性。
2. 高分子材料研究
聚合物分子量分布：測定合成高分子(如聚乙烯、聚丙烯酸)的分子量及其分布(GPC，凝膠滲透色譜，屬于體積排阻色譜的一種)。
聚合物純度與降解：檢測聚合物中的低聚物、雜質或降解產物。
3. 藥物研發與質量控制
生物藥分析：
ADC 藥物(抗體 – 藥物偶聯物)中游離藥物與偶聯物的分離。
宿主細胞蛋白(HCP)與目標蛋白的快速分離(如細胞培養液純化監控)。
小分子藥物輔助分析：分離藥物中的高分子雜質(如蛋白類污染物)。
4. 其他領域
食品與農業：檢測食品中多糖(如果膠、淀粉)的分子量，評估品質。
環境科學：分離環境樣品中的高分子污染物(如腐殖酸)。
體積排阻色譜柱是利用 “分子篩” 原理實現分子尺寸分離的工具，具有溫和、高效、無樣品損失的特點，尤其適合生物大分子的分析與純化。隨著生命科學與材料科學的發展，其在藥物研發、質量控制、基礎科研中的應用將更加廣泛。如需選擇具體型號(如恒譜生 Bio-SEC 柱)，需根據目標分子尺寸、檢測需求(如靈敏度、載樣量)及儀器兼容性綜合考量。
四、體積排阻色譜柱與其他色譜柱的比較
1、分離機制：核心差異
| 色譜類型 | 分離機制 | 關鍵影響因素 |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | 基于分子尺寸（ hydrodynamic volume）差異，利用填料孔隙的 “分子篩效應” 分離： - 大分子無法進入孔隙，先流出； - 小分子進入孔隙，后流出。 |
填料孔徑大小、分子體積 / 形狀 |
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | 基于分子疏水性差異： ‘- 疏水性強的分子與固定相（如 C18）作用強，保留時間長； ‘- 極性分子先流出。 |
固定相疏水性（C18/C8 等）、流動相極性（如乙腈 / 水比例） |
| 離子交換色譜柱（IEC） | 基于分子電荷差異： ‘- 帶電荷分子與固定相（如磺酸基 / 季銨基）發生靜電吸附，電荷密度高的分子保留時間長。 |
固定相電荷基團類型（陽離子 / 陰離子交換）、流動相 pH 和離子強度 |
| 親和色譜柱（AC） | 基于生物分子特異性相互作用（如抗體 – 抗原、酶 – 底物）： ‘- 目標分子與固定相配體特異性結合，其他分子先流出，通過改變條件洗脫目標分子 |
配體類型（如 Protein A、肝素）、洗脫條件（pH、競爭性分子） |
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | 基于分子極性差異： ‘- 極性分子與固定相（如硅膠、氨基柱）作用強，保留時間長； ‘- 非極性分子先流出。 |
固定相極性（硅膠 / 氰基柱等）、流動相極性（如正己烷 / 異丙醇比例） |
2、填料特性：決定分離機制的基礎
| 色譜類型 | 填料材質與結構 | 孔徑與表面性質 |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | 多孔凝膠填料（如硅膠基質微球、葡聚糖、瓊脂糖），孔徑分布均勻，表面惰性（減少非特異性吸附）。 | 孔徑大小決定分離范圍（如小孔徑分離低分子量，大孔徑分離蛋白質等大分子）。 |
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | 硅膠基質鍵合疏水性基團（如 C18、C8、苯基），表面疏水。 | 孔徑通常較小（6-12 nm），適合小分子（<2000 Da）。 |
| 離子交換色譜柱（IEC） | 硅膠或聚合物基質鍵合離子基團： | 孔徑適中（8-10 nm），表面帶電荷，需控制流動相 pH 使目標分子帶電。 |
| - 陽離子交換（如磺酸基 – SO??）； | ||
| - 陰離子交換（如季銨基 – NR??）。 | ||
| 親和色譜柱（AC） | 基質（如瓊脂糖、硅膠）偶聯特異性配體（如 Protein A、鎳離子、肝素）。 | 大孔徑（如瓊脂糖凝膠孔徑可達數百 nm），便于大分子擴散結合配體。 |
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | 極性固定相（如未鍵合硅膠、氨基柱、氰基柱），表面富含羥基或極性基團。 | 孔徑較小，依賴表面極性基團與分子相互作用。 |
3、應用場景：因機制而異
| 色譜類型 | 典型應用 | 適合的樣品類型 |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | - 生物大分子分離：蛋白質聚集體、核酸構型、病毒顆粒完整性分析； | 大分子（>1000 Da）、對剪切力 / 化學環境敏感的生物樣品（如抗體、酶）。 |
| - 聚合物分子量分布測定（GPC）； | ||
| - 溫和條件下的樣品脫鹽或緩沖液交換。 | ||
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | - 小分子藥物分析（如阿司匹林、抗生素）； | 中低分子量（<5000 Da）、具疏水性的化合物（如多肽、小分子有機物）。 |
| - 多肽測序與純度檢測； | ||
| - 環境污染物（如 PAHs）分離。 | ||
| 離子交換色譜柱（IEC） | - 蛋白質電荷異構體分離（如單抗電荷異質性分析）； | 帶電生物分子（蛋白質、核酸、氨基酸），需通過 pH 調節電荷狀態。 |
| - 核酸分離（如質粒 DNA 純化）； | ||
| - 氨基酸分析。 | ||
| 親和色譜柱（AC） | -?抗體純化（Protein A/G?柱）； | 目標分子需具備特異性結合位點（如抗體 Fc 段、His 標簽），適合純化或互作分析。 |
| - 重組蛋白分離（His 標簽 – Ni 柱）； | ||
| - 受體 – 配體相互作用研究。 | ||
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | - 手性化合物分離； | 極性分子（如糖類、天然產物），流動相需用非極性溶劑（如正己烷）。 |
| - 極性小分子（如糖類、脂類）分析； | ||
| - 藥物中間體純度檢測。 |
4、關鍵對比總結
| 維度 | 體積排阻色譜柱（SEC） | 反相色譜柱（RP-HPLC） | 離子交換色譜柱（IEC） | 親和色譜柱（AC） |
| 分離核心 | 分子尺寸 / 孔徑篩分 | 疏水性差異 | 電荷差異 | 特異性生物相互作用 |
| 是否破壞樣品 | 否（溫和分離，無化學作用） | 可能（流動相含有機溶劑，可能變性） | 否（依賴電荷，不破壞結構） | 否（特異性結合，條件溫和） |
| 典型樣品 | 抗體、DNA、聚合物 | 小分子藥物、多肽 | 帶電蛋白、核酸 | 帶標簽蛋白、抗體 |
| 流動相要求 | 水相緩沖液（需維持樣品穩定） | 水 – 有機溶劑（如乙腈、甲醇） | 水相緩沖液（含鹽調節離子強度） | 水相緩沖液（需含特異性洗脫劑） |
| 分離速度 | 較快（分子僅按尺寸擴散，無吸附過程） | 中等（依賴疏水性相互作用動力學） | 中等（依賴電荷吸附平衡） | 較慢（需特異性結合 – 洗脫動力學） |
5、如何選擇色譜柱?
1. 根據樣品性質：
● 大分子、易變性樣品 → SEC 柱(如抗體聚集體分析)。
● 小分子、疏水性強 → 反相柱(如藥物含量檢測)。
● 帶電分子(如蛋白電荷異質性)→ 離子交換柱。
● 需高效純化特定生物分子 → 親和柱(如抗體純化)。
2. 根據分離目標：
● 按尺寸分級(如分子量分布)→ SEC;
●?按極性 / 疏水性分離 → 反相 / 正相;
● 按電荷分離 → 離子交換;
● 按特異性結合分離 → 親和。
通過以上差異對比，可根據具體實驗需求選擇最適配的色譜柱類型。例如，恒譜生 Bio-SEC 體積排阻色譜柱即針對生物大分子的尺寸分離優化，通過特殊鍵合工藝降低非特異性吸附，適合對靈敏度、柱壽命要求高的生物分析場景(如 ADC 藥物偶聯效率檢測、疫苗蛋白聚集狀態分析等)。
發布于: 2025-05-24